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NEST

實驗時刻

軟瓊脂克隆實驗

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗(Anehorage-independentassay），利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質，使細胞在懸浮狀態(tài)下生長。

軟瓊脂克隆形成實驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。

細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數(shù)量，主要反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

Part 01.

實驗材料

細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、瓊脂糖、結晶紫

細胞培養(yǎng)板、微量離心管（EP管）、移液吸頭、移液槍

Part 02.

實驗操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂（Agarose 加蒸餾水配置），高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當天微波爐或烘箱加熱融化，置于37攝氏度培養(yǎng)箱中。

2.鋪下層膠：按1：1比例混勻1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2毫升混合液，在室溫條件下等待冷卻凝固。

3.取對數(shù)生長期細胞，消化配置成單細胞懸液，計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)整為5*10^4/毫升。

4.鋪上層膠：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培養(yǎng)基混勻，取2毫升混合液于EP管中，向管中加入10-20微升細胞懸液，充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中，待上層瓊脂凝固后，放在37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，每三天向孔板中加入200微升培養(yǎng)基。

5.顯微鏡下拍照，統(tǒng)計克隆直徑并作圖。

常見問題與解答

Q：細胞密度為多少合適？

A：細胞接種密度與最終實驗結果密切相關，若細胞太多，形成克隆數(shù)目太多，處理結果時數(shù)克隆不僅容易出錯，而且圖片很難看（下圖左）。細胞太少，不能形成克隆。如下圖所示：

上圖我們看到3株癌細胞在6孔板克隆形成圖片，第一個明顯鋪板細胞太密集，導致難以統(tǒng)計數(shù)據(jù)；中間那個正好，最后面那個細胞數(shù)量偏少，且細胞鋪板不均勻。因此，為了獲得美觀的圖片和準確的數(shù)據(jù)，第一次實驗最好設置細胞接種梯度，如500-1000-2000-5000個/孔挑選出最合適的接種密度。細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度，否則結果的準確度會受到很大影響；另外注意細胞計數(shù)時建議多計數(shù)幾次。

Q：細胞接種后培養(yǎng)的時間，如何確定？

A：通常情況下，單個細胞在體外增殖6代以上所組成的細胞群稱為一個陽性克隆，時間約為一周；但具體時間因細胞增殖能力而已異，因此應密切關注細胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個克隆細胞數(shù)到達50個左右即可固定細胞。

Q：細胞鋪板均勻的重要性

A：若鋪板不均勻，細胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影響統(tǒng)計結果，并且拍出的圖片不美觀。

Q：細胞未形成克隆的原因？

A：并非每種細胞都可以形成克隆，克隆形成率與細胞本身增殖能力有關。還與接種細胞密度，加入培養(yǎng)液的體積、血清濃度有關。因該實驗處理時間較長，應給細胞多加培養(yǎng)基，如每孔4ml，或者3天更換一次培養(yǎng)基，以供給細胞充足的營養(yǎng)。

Q：計數(shù)時克隆數(shù)目較多，有什么快捷辦法？

A：只要細胞鋪板均勻，我們可以選擇分區(qū)計數(shù)，取平均數(shù)。

注意事項

1.細胞一定要吹打分散成單細胞懸液

2.接種時細胞密度不可過高

3.軟瓊脂與細胞混合時溫度不可過高，容易燙傷甚至燙死細胞。